做過分子實(shí)驗(yàn)的人都知道，要想做的有效率有質(zhì)量是很困難的，1 個(gè)月做 100 個(gè)克隆那都是 小 case，沒點(diǎn)看家的本事怎么行。如果再遇到比較稀有的基因，周旋個(gè)把月，那也是家常便飯。下面遠(yuǎn)慕生物就和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn)，從此邁向科研達(dá)人！

1. 準(zhǔn)備工作

俗話說：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，效果事半功倍哦。 推薦兩個(gè)工具，一個(gè)是 oligo 軟件，常用于引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)分析；另一個(gè)是 DNAstar 軟件，工具ji強(qiáng)大，一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件，用作 DNA 和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。

2. 設(shè)計(jì)引物

1) 注重要：看懂質(zhì)粒圖譜！拿大家比較熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來 結(jié)果根本不表達(dá)融合蛋白，你就死了；C1 質(zhì)粒，注意閱讀框，要是移碼了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話，要看懂你的圖譜！

其他需要注意：

*設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)要加保護(hù)堿基（大家要用 T 載體就當(dāng)我沒說）;

*酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則：盡量用粘性末端，實(shí)在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后還有別的用處就多加點(diǎn)酶切位點(diǎn)，曾一口氣在引物上加了五個(gè)酶切位點(diǎn)以防以后要用到，注意計(jì)算 TM 值的時(shí)候要減去這些不匹配的序列；

*注意 KOZAK 序列的問題，很多質(zhì)粒沒有提供 KOZAK 序列，這要在設(shè)計(jì)的時(shí)候直接在引物上加好。

*擅用 Gene Overlap，比方說加個(gè) flag 標(biāo)簽，his 標(biāo)簽，my 標(biāo)簽之類的，直接設(shè)計(jì)三引物 overlap 一下就可以，省得還要再多構(gòu)建一步，這些都是設(shè)計(jì)引物時(shí)候就要考慮好的。引物長(zhǎng)一點(diǎn)不要緊（兩步法），尤其是對(duì) GC 比高的序列，有時(shí)候引物不長(zhǎng) PCR 根本不出結(jié)果，注意如果 GC 比較高，這個(gè)時(shí)候 Gene Overlap 就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。

*沒有合適的酶切位點(diǎn)？很簡(jiǎn)單，用同尾酶策略，比方說 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意連上了切不下來），實(shí)在不行就平端吧。

3. PCR 擴(kuò)增

如果沒有現(xiàn)成的質(zhì)粒可供酶切，PCR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可選擇的 PCR 酶實(shí)在太多，每隔一段時(shí)間還會(huì)升級(jí)，正常情況下，高保真的 taq 酶都能滿足需求。但如果遇到難 PCR 的高 GC 基因，可以換不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，實(shí)在不行可以考慮 Clontech 的 2 GC rich kit，價(jià)格和實(shí)力都大牛。另外，建議電泳切膠回收純化 PCR 產(chǎn)物， 去除一些非特異性條帶。

4. 酶切

強(qiáng)烈推薦 NEB 的內(nèi)切酶，記得有一次用別家的酶切過夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當(dāng)然當(dāng)時(shí)質(zhì)粒濃度也不高），而用 NEB 的酶，切個(gè)七十二小時(shí)仍舊一切 OK，尤其現(xiàn)在 NEB 還推出了 HF 的內(nèi)切酶，沒有星活性而且統(tǒng)一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也還可以。

5. 連接

常用的是 NEB 的 T4 連接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反復(fù)凍融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分裝，10uL/管，一次性使用。

載體總量：一般來說，載體濃度在 20-100ng/uL 較好，太低的話碰撞幾率低，太高的話又會(huì)產(chǎn)生很多非目的克隆，總量從 50-100ng 就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會(huì)很麻煩，反應(yīng)總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對(duì)感受態(tài)細(xì)胞也是個(gè)挑戰(zhàn)，通用 10-15uL。

載體和插入片段比例：載體和插入片段比例一般是 1:7，如果很難連接，比如說平端連接，要適當(dāng)提高片段濃度，同時(shí)加大比例 1:10。

6. 轉(zhuǎn)化

按照 SOP 做就行，話說實(shí)驗(yàn)室原來從 takara 買感受態(tài)（competent cell），后來發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高（protocol 免費(fèi)索?。Ｒ⒁獾氖?LB 必須無菌而且沒有抗生素。

7. 鑒定

想要快速鑒定，建議用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定講究的，很多人做菌液 PCR 鑒定假陽性特多，為什么？因?yàn)槟?PCR 引物選的都在載體上，注意引物必須分別在載體和插入片段上才準(zhǔn)，PCR 方法鑒定是極其準(zhǔn)確的，數(shù)百次菌液 PCR 經(jīng)驗(yàn)。PCR 鑒定做起來也很簡(jiǎn)單， 拿個(gè) 2mL tube，裝 0.5mL 加入相應(yīng)抗生素的 LB，搖個(gè)三小時(shí)左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不錯(cuò)，效果一樣。

8. 測(cè)序

拿到測(cè)序結(jié)果時(shí)，不僅要核對(duì)序列，還要看測(cè)序峰圖，這很重要。因?yàn)橛袝r(shí)候光看序列對(duì)，實(shí)際上圖顯示的不對(duì)，或者雖然序列結(jié)果不對(duì)，但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信，出現(xiàn)突變也不怕，有很大可能性是簡(jiǎn)并密碼子；還要重點(diǎn)檢查的地方就是“接頭"的地方，因?yàn)榕紶栆飼?huì)出錯(cuò)，比方說少個(gè)堿基什么的，還有時(shí)候酶切之后連接也會(huì)丟一兩個(gè)堿基什么的，如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無及。