【實(shí)驗(yàn)原理】
DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象,因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作,那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)做到:1、根據(jù)不同研究需要,保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。
核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì),通常情況下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后,再用有機(jī)溶劑抽提,在單價(jià)陽(yáng)離子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量時(shí),應(yīng)在260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)下讀數(shù)。在260nm的讀數(shù)用于計(jì)算樣品中的核酸濃度,OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA,40μg/ml單鏈DNA或RNA及大約20μg/ml單鏈寡核苷酸。根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度。DNA及RNA純品的OD260/OD280值分別是1.8和2.0,如果樣品中污染有蛋白或酚,其OD260/OD280將明顯低于此值,此時(shí)無(wú)法對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。
【實(shí)驗(yàn)用品】
1.臺(tái)式離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計(jì)；一次性塑料手套。
2.微量加樣器(1000μl,200μl,20μl)；Tip頭(1000μl,200μl,20μl)。Tip頭盒(1000μl,200μl,20μl)；Eppendorff管(2ml,1.5ml,0.5ml),Eppendorff管架。
3.DNA提取的相關(guān)試劑:
1)蛋白酶K(10mg/ml),-20℃保存。
2)TE(pH 8.0):10mmol/L Tris.Cl(pH 8.0),1mmol/L EDTA(pH 8.0), 15磅高壓滅菌后室溫保存。
3)10% SDS:10g SDS溶于90ml 水中,加熱68℃助溶,加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2,加蒸餾水定容至100ml,室溫保存。
4)3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2,加水定容至1L,高壓滅菌,室溫保存。
5)飽和氯化鈉,70%乙醇,氯仿
6)飽和酚
【實(shí)驗(yàn)步驟】
飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA
1.取0.5ml抗凝全血,加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；
2.室溫離心,10000rpm ,1分鐘；
3.棄上清,加入0.4ml TE(pH 8.0),混勻,懸浮細(xì)胞；
4.加入10mg/ml蛋白酶K 5μl(終濃度100μg/ml),10% SDS 25μl(終濃度0.5%),混勻；
5.37℃水浴消化過(guò)夜,或50℃消化4小時(shí)；
6.加入1/3體積的飽和氯化鈉,充分混勻,4℃靜置10分鐘；
7.10000rpm離心10分鐘,取上清于另一新管中；
8.加入等體積氯仿,混勻,10000rpm離心10分鐘；
9.取上清于另一新管中,加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；
10.加入2倍體積無(wú)水乙醇輕輕混合,10000rpm離心1分鐘；
11.棄上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗滌；
12.10000rpm離心1分鐘,棄上清,自然干燥DNA約5分鐘；
13.加入200-250μl TE,-20℃保存；
14.檢測(cè)濃度及純度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1.外周血反復(fù)凍溶破壞紅細(xì)胞,取0.5ml外周血,加入0.5ml PBS混勻后,10000rpm 離心10分鐘；
2.棄上清,加入180μl TE(pH 8.0),20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl(終濃度100μg/ml)混勻；
3.37℃水浴消化過(guò)夜,或50℃消化4小時(shí)；
4.加入等體積的飽和酚并充分混勻,10000rpm離心10分鐘；
5.吸取上清液于另一新管中,重復(fù)上一步驟一次；
6.吸取上清液于另一新管中,加入等體積的酚氯仿并充分混勻,10000rpm離心10分鐘；
7.吸取上清液于另一新管中,加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后,加入2倍體積無(wú)水乙醇并輕輕混合,可見(jiàn)絮狀乳白色DNA團(tuán)塊,10000rpm離心10分鐘；
8.棄上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗滌；
9. 10000rpm離心1分鐘,棄上清,自然涼干后加入TE液,-20℃保存；
10.檢測(cè)濃度及純度
組織總RNA的提取
1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min,擊碎后回收入2ml無(wú)菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進(jìn)行組織勻漿,樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIZOL試劑體積的10%；
2.將組織勻漿液在15-30℃放置5min,促使核蛋白復(fù)合物*解離,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)12000g,離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30℃放置10min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)12000g,離心10min；
4. 棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)7500g,離心5min；
5. 室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃溫浴10min).
6. 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度；
7. 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA,每孔上樣25μg,65V,2.5h,以檢測(cè)RNA的質(zhì)量。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】
1. 計(jì)算已提取的DNA的濃度和純度
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